Kỹ thuật real-time PCR phát hiện và định lượng trực tiếp genomic copies của vi khuẩn B. thailandensis

Kỹ thuật real-time PCR phát hiện và định lượng trực tiếp genomic copies của vi khuẩn B. thailandensis

08/04/2021

 Melioidosis là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm do vi khuẩn đất Burkholderia pseudomallei gây nên. Điều tra sự phân bố của vi khuẩn B. pseudomallei ngoài môi trường cho thấy tần suất bắt gặp vi khuẩn B. pseudomallei trong đất canh tác nông nghiệp ở nước ta dao động từ 0,9% (miền Bắc), đến 4,7% (miền Nam) và 9,8% (miền Trung). Mặc dù các hoạt động nghiên cứu về bệnh melioidosis đã được chú ý, nhưng số lượng ca bệnh phát hiện ở nước ta còn rất khiêm tốn, thấp hơn nhiều so với các nước trong cùng khu vực địa lý, có cùng nét tương đồng về phương thức canh tác nông nghiệp, nơi đa số người dân có nguy cơ phơi nhiễm cao với vi khuẩn B. pseudomallei do hoạt động canh tác nông nghiệp tiếp xúc hàng ngày với đất và nước. Theo dự báo, mỗi năm ở Việt Nam có khoảng 10.430 ca bệnh nhiễm melioidosis và con số tử vong khoảng 4.703 ca. Phân tích số liệu cho thấy, số lượng ca thực tế phát hiện ở các nước trong khu vực chỉ thấp hơn so với số lượng ca dự đoán chỉ từ 1,76 đến 4,63 lần. Tuy nhiên, số lượng ca melioidosis phát hiện ở nước ta trung bình chỉ khoảng 110 ca/năm, thấp hơn khoảng 100 lần so với con số dự báo. Có nhiều giả thuyết đã được đưa ra để lý giả cho sự bất thường về số lượng ít ca nhiễm bệnh được phát hiện ở nước ta so với các nước trong khu vực như: i) bỏ sót xét nghiệm ca bệnh hoặc bỏ sót ca bệnh tại các bệnh viện; ii) do độc lực vi khuẩn B. pseudomallei ở Việt Nam không đủ mạnh hoặc iii) do tộc người Việt miễn dịch tự nhiên với vi khuẩn B. pseudomallei.

Với ý nghĩa quan trọng và cấp bách của bệnh melioidosis do B. pseudomallei gây nên, Bộ Khoa học và Công nghệ đã phê duyệt và ký hợp đồng thực hiện nhiệm vụ KH&CN theo Nghị định thư “Nghiên cứu các yếu tố nguy cơ, đáp ứng miễn dịch và đặc điểm di truyền của Burkholderia pseudomalleiBurkholderia thailandensis tại Việt Nam”. Đây là nhiệm vụ KH&CN có sự hợp tác giữa Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học với Trường Đại học Imperial College London, Anh nhằm giải quyết vấn đề đặt ra ở trên.

Trong quá trình nghiên cứu điều tra vi khuẩn B. pseudomallei phân bố ngoài môi trường, nhóm nghiên cứu về melioidosis đã phát hiện vi khuẩn B. thailandensis phân bố rất nhiều trong ruộng lúa tại các vùng ở Việt Nam. 90% đất của Việt Nam có vi khuẩn B. thailandensis trong khi đó tỷ lệ bắt gặp vi khuẩn này trong đất ở Thái Lan là rất thấp. Giống như B. pseudomallei, B. thailandensis phân bố tự nhiên trong đất và trong nước, nhưng khác với B. pseudomallei vi khuẩn B. thailandensis không gây bệnh cho người và động vật. Hai loài vi khuẩn có quan hệ rất gần gũi với nhau về mặt di truyền, đặc điểm hình thái và sinh vật hóa học. Đặc biệt, các thử nghiệm gây đáp ứng miễn dịch chuột tiếp xúc với vi khuẩn B. thailandensis cho thấy khả năng bảo vệ chuột sống sót ở liều tiêm thử thách với B. pseudomallei gấp 6.000 lần liều lượng gây chết. Điều đó chứng tỏ, phơi nhiễm với B. thailandensis có khả năng giúp cơ thể tạo nên các đáp ứng miễn dịch mà ở đó kháng thể tạo ra sẽ phản ứng chéo với kháng nguyên của B. pseudomallei. Các minh chứng này củng cố cho một giả thuyết (giả thuyết thứ iii) lý giải số lượng ca nhiễm melioidosis thấp tại Việt Nam có thể là do tần suất bắt gặp vi khuẩn B. thailandensis cao trong đất ở Việt Nam sẽ giúp cho người Việt có cơ hội phơi nhiễm cao với vi khuẩn, qua đó vô tình tạo nên đáp ứng miễn dịch phản ứng chéo với vi khuẩn B. pseudomallei.

Hình ảnh khuẩn lạc B. thailandensis (bên trái) và B. pseudomallei (bên phải) nuôi cấy trên môi trường chọn lọc Ashdown ở nhiệt độ 37oC
Phản ứng dương tính với que thử nhanh Active Melioidosis Detect (AMD) của chủng B. thailandensis 35P và B. pseudomallei (ĐC +). Điều đó chứng tỏ chủng B. thailandensis 35P cũng có kháng nguyên lipopolysaccharide (LPS) tương tự như của B. pseudomallei

Để giải thích được các giả thuyết trên thì cần có một cuộc điều tra nghiên cứu tổng thể, bao gồm nhiều lĩnh vực như vi sinh môi trường, vi sinh lâm sàng, sinh hóa, sinh học phân tử, protein tái tổ hợp và miễn dịch học. Các chuyên gia trong từng lĩnh vực sẽ phối hợp điều tra tạo nên các bộ số liệu về sự phân bố và tỷ lệ bắt gặp của vi khuẩn B. pseudomallei/ B. thailandensis trong môi trường đất, đánh giá đáp ứng miễn dịch với B. pseudomallei/ B. thailandensis của người Việt từ đó tìm hiểu về đáp ứng miễn dịch tế bào - dịch thể thông qua tế bào lympho T. Tổng hợp các bộ số liệu và mối tương quan giữa các số liệu không những sẽ giúp chúng ta lý giải bản chất khoa học/bản chất tự nhiên của quá trình phơi nhiễm với B. pseudomallei/ B. thailandensis và biểu hiện triệu chứng lâm sàng melioidosis mà còn giúp các nhà quản lý của Việt Nam tiếp cận và đảm bảo tốt công tác cảnh báo, dự phòng và quản lý melioidosis.

Tháng 3/2021, Bộ Khoa học và Công nghệ đã tổ chức đoàn kiểm tra gồm các đơn vị chức năng (Văn phòng các Chương trình KH&CN quốc gia, Vụ Hợp tác quốc tế) và chuyên gia PGS.TS Nguyễn Thái Sơn để đánh giá tình hình thực hiện hợp đồng thực hiện nhiệm vụ KH&CN theo Nghị định thư “Nghiên cứu các yếu tố nguy cơ, đáp ứng miễn dịch và đặc điểm di truyền của Burkholderia pseudomalleiBurkholderia thailandensis tại Việt Nam”.

Theo báo cáo của Tổ chức chủ trì, bước đầu nhóm nghiên cứu đã phát triển thành công kỹ thuật real - time PCR phát hiện trực tiếp vi khuẩn B. thailandensis trong đất. Phương pháp real - time PCR sử dụng cặp primer và probe BTH_II0364 được đánh giá hoàn toàn phù hợp để định lượng vi khuẩn B. thailandensis trong đất và có thể thay thế phương pháp cấy đếm truyền thống trong các nghiên cứu tiếp theo về điều tra tần xuất bắt gặp loài vi khuẩn này ngoài môi trường.

Chuyên gia PGS.TS Nguyễn Thái Sơn đánh giá việc nghiên cứu miễn dịch chéo giữa vi khuẩn B. pseudomalleiB. thailandensis là điểm mới của nhiệm vụ, có ý nghĩa rất lớn trong việc công bố khoa học trên thế giới. Các kết quả nghiên cứu đạt được ở giai đoạn đầu của Tổ chức chủ trì có hàm lượng khoa học cao. Nhờ việc phát triển thành công kỹ thuật real - time PCR định lượng vi khuẩn B. thailandensis trực tiếp từ môi trường, nhóm nghiên cứu sẽ đánh giá mối tương quan giữa số lượng ca nhiễm bệnh và tần xuất phân bố hai loài vi khuẩn này trong đất. Qua đó, nghiên cứu sẽ đưa ra câu trả lời thỏa đáng cho các giả thuyết đặt ra về khả năng đáp ứng miễn dịch của người dân phơi nhiễm tự nhiên với vi khuẩn B. pseudomallei. Kết quả nghiên cứu dự kiến sẽ được ứng dụng triển khai trực tiếp tại các bệnh viện, có ý nghĩa quan trọng trong y tế, đời sống và xã hội.